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3044永利:马炯/糜岚课题组提出新型高密度生物荧光图像重构方法

   超分辨显微镜是现代生物医学应用最广泛的成像工具之一,克服了衍射极限对传统光学显微镜分辨能力的限制。在实现较高的空间分辨率的基础上,进一步提高时间分辨率,获得更快的成像速度是超分辨技术的目标。提高成像时间分辨率需要更高的图像荧光激发密度,然而高密度荧光会导致图像重构的伪影增加,空间分辨率降低,不利于时间分辨率的提升。

        59日,3044永利光科学与工程系马炯/糜岚课题组在期刊ACS PhotonicsArticle形式在线发表题为“Achieving Increased Resolution and Reconstructed Image Quality with Intensity and Gradient Variance Reweighted Radial Fluctuations”的文章。该研究在荧光涨落超分辨技术中首次引入梯度统计方差分析,形成一种新型的超分辨显微成像技术VRRF,该技术大幅提高了生物荧光图像重构质量和分辨率。

   荧光标记的生物样品在高密度荧光激发下,两个荧光分子经过成像系统衍射产生的光斑会部分重叠,在荧光强度上无法分辨。传统单分子定位算法、SRRF等通过计算或趋近强度峰值来复原荧光分子位置的算法,就会因此产生伪影信号,导致最终重构图像的实际分辨率下降。SOFI重构算法证明,只要荧光强度随时间的涨落具有随机性,相互独立不相关,通过计算强度涨落的相关性可以更好地分辨重叠荧光分子。SOFI算法提升分辨率的能力依靠更高阶的相关性计算,但是图像会因此产生严重伪影,提升效益降低。

   该研究从扩充涨落分析参数角度出发,将荧光梯度涨落纳入到涨落分析的框架中,和强度涨落相结合。通过联系两个参数的涨落特征与荧光分子的分布发现,在非荧光分子中心,荧光强度涨落随机叠加,强度方差趋于局部谷值,荧光梯度矢量受到周围荧光分子涨落的影响,波动程度较大,梯度方差趋于局部峰值。而在荧光分子中心,则强度方差趋于局部峰值,梯度方差趋于谷值。

   为了解析重叠的荧光分子,根据荧光强度、梯度的涨落特性,定义权函数为强度方差与梯度方差的比值。权函数曲线揭示两个近距离重叠荧光分子的能力相比衍射极限提高约2.2倍,分辨率极限可达90 nm。使用权函数对原始的图像序列进行修正,即可将更多的重叠荧光分子分开。再进行图像重构就可以减少荧光分子之间原始强度重叠导致的伪影,实现空间分辨率的提升。该研究结合权函数与SRRF算法,提出强度与梯度方差修正的径向度涨落算法(Intensity and gradient variance reweighted radial fluctuations,VRRF) 。该算法在处理图像序列时,首先将图像进行2倍插值提高计算精度,随后进行统计方差分析,计算权函数,用权函数对原始序列进行修正,分离更多强度重叠的荧光分子,最后使用SRRF算法完成重构。

在生物结构模拟图像序列重构的测试中,VRRF重构图像相比于SRRF实现了伪影的消除和分辨率的提升。双线结构达到90 nm的分辨率,圆环结构达到80 nm的分辨率。同时,算法在不同荧光密度、不同信噪比的条件下重构质量较稳定,表现出广泛的适用性。

          VRRF算法不仅适用于高密度定位图像,还适用于普通宽场荧光图像,对多种成像技术,如Airyscan共聚焦显微镜、结构光照明显微镜(SIM)等获取的图像重构质量都有提升作用。在实验图检验中,VRRF算法表现出重构质量提升。具体表现在:第一,分辨精细细胞结构的能力提升,复原荧光较弱和荧光不均匀的结构完整性较好。第二,重构交叉结构的畸变和伪影减少,有效压低背景噪声,对SIM算法伪影也能起到抑制作用。

   整体上,该研究提出的高密度图像重构算法VRRF可有效消除伪影和噪声,提升高密度图像重构的空间分辨率,对多种高分辨成像技术获取的图像重构效果都具有提升效果。保持高密度图像重构的空间分辨率和图像质量,将有助于提高成像时间分辨率,对提升活细胞动态成像效果具有积极意义。

 

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